Què és una prova de PCR?
Una prova de PCR és un mètode de laboratori utilitzat en biologia molecular i medicina. La prova s'utilitza per a la detecció directa i la caracterització de material genètic. Els experts consideren que el mètode PCR és fàcil de realitzar, aplicable universalment i robust.
Al laboratori, una prova de PCR consta de dos passos. En el primer pas, el material genètic existent s'amplifica mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Això permet examinar els rastres més petits d'ADN. Aquesta és també la raó per la qual les proves de PCR reaccionen de manera tan sensible.
En un segon pas, el material genètic es separa segons les seves propietats, "s'ordena" i així es caracteritza. En altres paraules, es determina l'estructura fina de l'ADN.
Hi ha moltes aplicacions possibles: els metges utilitzen una prova de PCR, per exemple, per examinar hisopos per detectar la presència de coronavirus, donacions de sang per VIH o per detectar possibles malalties hereditàries als nounats. Les infeccions bacterianes, per exemple amb el patogen de la tuberculosi, o les infeccions parasitàries (malària) també es poden aclarir mitjançant la PCR.
També ajuden a condemnar els autors en medicina forense sobre la base de les seves empremtes genètiques o s'utilitzen com a proves de paternitat.
Quant de temps és vàlida una prova de PCR?
Un resultat de la prova de PCR sol ser vàlid durant 48 hores des del moment en què es pren la mostra.
Què tan fiable és una prova de PCR?
La PCR és un mètode de detecció provat i provat en diagnòstic molecular i medicina. Es considera l'anomenat estàndard d'or amb una taxa d'error molt baixa. Les proves es caracteritzen sobretot per una sensibilitat i especificitat molt elevades.
Sensibilitat significa la fiabilitat amb què una prova troba el material genètic que s'ha de detectar.
Especificitat significa la certesa amb què la prova determina que el material genètic en qüestió no està present a la mostra.
Quan funcionen les proves de PCR per a una infecció per Sars-CoV-2?
Per regla general, la prova de PCR detecta una infecció per corona dos o tres dies abans i fins a 20 dies després de l'aparició dels símptomes. Fins i tot en persones infectades que es mantenen completament lliures de símptomes, la prova és eficaç en una finestra de temps crítica en què poden infectar altres persones.
En casos individuals, la detecció és possible fins i tot 60 dies després de l'aparició dels símptomes.
Possibles fonts d'error
La taxa d'error en el procés de còpia d'ADN és insignificant a la pràctica. Tot i que les ADN polimerases mai estan lliures d'errors, amb prou feines tenen un paper en el procediment de prova de PCR.
A la pràctica, les possibles fonts d'error es troben més en la recollida de mostres: per tant, és important que els professionals mèdics formats facin els hisops. Les mostres de saliva i gàrgares podrien reduir la precisió de la prova, ja que aquí es produeixen efectes de dilució.
Com funciona una prova de PCR?
Una prova de PCR la realitza, per exemple, un metge de família o en centres especials de prova. En primer lloc, els metges o professionals mèdics formats prenen una mostra. Normalment es pren un hisop de les vies respiratòries superiors per a la prova. Això sol prendre la forma d'un hisop bucal o nasofarínge.
També és possible fer gàrgares amb una solució d'esbandida. Una mostra de sang és atípica per a la detecció de corona, però s'utilitza àmpliament en la detecció de nounats, per exemple.
Independentment del tipus de mostra presa, el material genètic es troba al hisop de cotó, a la solució d'esbandida o a la gota de sang. Aquest material de mostra s'envia a un laboratori, on s'aïlla i es purifica.
A continuació, una prova de PCR es divideix en dos passos:
- PCR: En aquest pas, s'amplifica la quantitat de material genètic inicial.
Pas 1: PCR - "La reacció en cadena de la polimerasa"
La "PCR" és el primer dels dos passos: aquí és on s'amplifica la quantitat d'ADN inicial disponible. Això es deu al fet que el material genètic només es pot analitzar quan estigui disponible en quantitats suficients. En la majoria dels casos, es tracta d'ADN humà; en el cas de les proves de coronavirus, es tracta d'ARN viral.
L'abreviatura PCR significa "reacció en cadena de la polimerasa".
Què es necessita per a una PCR?
L'ADN inicial es col·loca en un recipient de reacció amb substàncies especials. El material genètic existent serveix com a plantilla, que es copia en presència de certs enzims (Taq polimerasa) i certs blocs bàsics de construcció d'ADN.
El procés de còpia té lloc en diverses execucions repetitives (cicles).
En concret, s'afegeixen les substàncies següents:
- ADN inicial: material de mostra que s'ha de copiar.
- Elements bàsics de construcció de l'ADN: són les nucleobases adenina, timina, citosina i guanina.
- ADN polimerasa: Un enzim que enllaça els blocs de construcció d'ADN individuals per formar una cadena d'ADN ben definida. El fil recent obtingut és una imatge mirall (complementària) del material de partida original.
- Primers: Consten de 16 a 24 parells de bases i serveixen com a posició inicial i senyal d'inici. Els cebadors mostren l'ADN polimerasa en quina posició (de l'ADN inicial) comença el procés de còpia.
Com es realitza una prova de PCR?
Ara que totes les substàncies necessàries per a una PCR estan presents al vas de reacció, pot començar el procés de còpia real del material genètic. Això s'inicia, controla i torna a aturar-se només per la temperatura.
Per tant, el recipient de reacció s'escalfa o refreda a diferents temperatures una darrere l'altra. Això es fa mitjançant un dispositiu especial conegut com a termociclador. Tota la reacció dura entre una i dues hores.
Els passos individuals d'un cicle de PCR són
- Desnaturalització de les cadenes dobles d'ADN: la mostra s'escalfa a uns 90 graus centígrads. Això separa la doble cadena d'ADN original en dues cadenes individuals (complementàries).
- Col·locació de les imprimacions: la temperatura es redueix lleugerament per sota dels 60 graus centígrads. Això fa que els cebadors (primer directe, cebador invers) s'uneixin a posicions definides a les cadenes d'ADN individuals corresponents.
Després d'un cicle complet, la temperatura s'eleva de nou fins als 90 graus centígrads; el cicle torna a començar des del principi.
El mètode PCR es pot utilitzar per amplificar seqüències d'ADN de fins a uns tres parells de quilobases (kbp). Això correspon a uns 3,000 blocs bàsics d'ADN units entre ells per formar una "cadena". Per comparació: el genoma humà emmagatzema els plànols i la informació per al funcionament de la cèl·lula en uns tres mil milions de parells de bases; el genoma del coronavirus, en canvi, consta de 30,000 parells de bases. Per tant, una prova de PCR només pot amplificar i examinar seccions curtes de l'ADN total.
Els primers són crucials
L'elecció dels primers és crucial per al procediment de PCR. En el diagnòstic de Sars-CoV-2, per exemple, s'utilitzen diversos cebadors (PCR múltiplex).
Així, les proves Corona PCR cerquen tres gens de virus diferents: això augmenta l'especificitat general a gairebé el 99.99%. Això vol dir que amb aquesta alta taxa d'èxit, només hi ha una prova de fals positiu per cada 10,000 proves (si es prenen mostres correctament).
Quant de material genètic copiat hi ha ara disponible?
Suposem que hi ha dues cadenes dobles d'ADN idèntiques després del primer cicle.
Després de cada cicle, la quantitat de material genètic (copiat) es duplica. Per tant, la quantitat d'ADN creix exponencialment.
Els metges solen repetir aquest procés entre vint i trenta vegades.
En sentit figurat, això vol dir que encara que només es trobi una única cadena doble d'ADN a la mostra al principi, després de vint cicles ja hi ha un milió de còpies idèntiques al recipient de reacció.
Què significa el valor Ct?
El nombre de cicles de PCR executats s'indica en forma de l'anomenat valor Ct. "Ct" es deriva del terme anglès "cycle threshold". Aquest valor Ct permet fer declaracions sobre la quantitat de material genètic que s'està buscant.
Amb un valor Ct baix de 20, hi ha molt material genètic inicial. Tanmateix, si el valor de Ct és alt (al voltant de 30 cicles), hi ha corresponentment poc ADN. Per tant, el cicle de PCR s'ha d'executar amb més freqüència.
Pas 2: electroforesi "Ordenació per mida"
Un cop es disposa de material genètic "enriquit" suficient, es pot dur a terme l'electroforesi. En aquest procés, els científics exploten una propietat específica de l'ADN: la seva càrrega elèctrica.
Els blocs de construcció individuals d'ADN estan units entre si mitjançant una columna vertebral de sucre i fosfat carregada (negativament). Com més llarga sigui una seqüència d'ADN particular, més gran serà la seva càrrega elèctrica.
Això permet examinar i caracteritzar el material genètic. A la pràctica, una mostra desconeguda se sol representar amb una referència coneguda en una "línia de partida" i es compara entre si després d'un període de temps determinat.
Si la "velocitat de migració" és la mateixa per a ambdues seqüències, això vol dir que la detecció és molt probable que sigui positiva: és molt probable que la detecció sigui positiva: el gen que busqueu està contingut a la mostra.
Cas especial de coronavirus: preparació de mostres i RT-PCR
La detecció del coronavirus és un cas especial. Sars-CoV-2 és un dels anomenats virus ARN. Això significa que el material genètic Sars-CoV-2 està present en forma d'ARN (àcid ribonucleic).
L'ARN només difereix de l'ADN en alguns aspectes. Entre altres coses, està present com una sola cadena i es basa en la ribosa de sucre en lloc de la 2′-desoxirribosa. La nucleobase timina també es substitueix per l'uracil com a quarta base.
Aquest ARN viral s'ha de "transcriure" a l'ADN abans d'una prova de PCR regular. Aquest procés s'anomena transcripció inversa (RT), d'aquí el terme RT-PCR. Com a part d'aquest procés s'obté una cadena única d'ADNc ("ADN complementari"). En un pas més, la cadena única d'ADNc es complementa amb una segona cadena d'ADN d'imatge mirall.
Quant de temps es triga a obtenir el resultat?
Un cop enviada la mostra al laboratori, normalment rebràs un resultat en un o dos dies hàbils. Als centres de proves, que sovint examinen les mostres directament in situ, també poden trigar unes poques hores. El període de temps depèn en gran mesura del centre de proves respectiu i de la seva logística.
Malgrat els complexos processos de treball, els laboratoris moderns són capaços de dur a terme proves de PCR amb un alt rendiment. Dispositius automatitzats especials ajuden a dur a terme les proves.
No obstant això, la prova de PCR es considera un mètode de detecció relativament "lent" però encara més fiable.
Què passa si el resultat és positiu?
Si la mostra es pren correctament, una prova de PCR positiva significa que hi ha una probabilitat molt alta que la persona provada estigui infectada amb Sars-CoV-2.
Si s'ha confirmat que està infectat amb el coronavirus mitjançant una prova PCR, el departament de salut pública rebrà una notificació del resultat positiu de la prova del laboratori corresponent. En aquest cas, el departament de salut pública ordenarà l'aïllament o la quarantena.
Estic contagiós automàticament si dono positiu a la PCR?
Normalment sí. Però no sempre. El resultat d'una prova de PCR sempre s'ha d'interpretar en context. Una prova positiva significa, en primer lloc, que portes material viral.
De vegades és útil una prova d'anticossos suplementària
En aquests casos, una prova d'anticossos proporciona certesa que confirma la validesa de la prova de PCR. El millor és discutir-ho amb el vostre metge. Poden ajudar-vos a interpretar correctament el resultat de la prova de PCR.
Què fer si el resultat és negatiu?
Un resultat negatiu de la prova de PCR probablement significa que no teníeu Covid-19 en el moment en què es va prendre la mostra i, per tant, actualment no sou infecciosos. Tanmateix, podríeu estar en una fase inicial d'infecció.
Les infeccions per corona normalment només es poden detectar a partir del segon o tercer dia després de la infecció. El resultat, per tant, no és una passada lliure. Per tant, hauríeu de seguir observant les normes de distanciament social i d'higiene i continuar fent servir una màscara FFP2, per a la vostra pròpia protecció i la dels altres.
Prova PCR per a nens
Una prova de PCR per a nens no és diferent d'una prova de PCR per a adults. Tant la recollida de mostres com la interpretació dels resultats s'apliquen tant a nens com a adults.
Quins són els riscos d'una prova de PCR?
Una prova de PCR no implica cap risc físic. Només la recollida de la mostra mitjançant un hisop nasofarínge és percebuda per algunes persones com a molesta o desagradable.
Què costa una prova de PCR?
Tingueu en compte: si us heu fet la prova a casa i heu rebut un resultat positiu, haureu de demanar una cita amb el vostre metge de capçalera immediatament per telèfon. El vostre metge discutirà amb vosaltres els propers passos per telèfon.
Alternativament, el millor és trucar al 116 117 per registrar-se a una prova de PCR. L'ideal és que et quedis a casa fins a la prova de confirmació per protegir-te i protegir els altres.
