Patch-clamp tècnica és el nom que rep una tècnica de mesura electrofisiològica. Permet mesurar els corrents iònics a través de canals individuals dins d’una membrana plasmàtica.
Què és la tècnica de patch-clamp?
La tècnica de patch clamp o mètode de patch clamp pertany a l’electrofisiologia, que és una branca de la neurofisiologia que s’ocupa de la transmissió electroquímica de senyals a la sistema nerviós. Amb l'ajut d'aquest mètode, és possible visualitzar canals iònics individuals a la membrana cel · lular d’una cèl·lula corporal. Això implica la mesura de corrents d'alguns picoamperis. La tècnica de patch-clamp va ser descrita per primera vegada el 1976 pel biofísic alemany Erwin Neher i el metge alemany Bert Sakmann. Els dos científics van rebre el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina el 1991 pel desenvolupament de la tècnica del clamp-patch. Així, la investigació electrofisiològica va ser pràcticament revolucionada per la tècnica de patch-clamp, ja que va obrir la possibilitat d’observar el comportament elèctric a la membrana. proteïnes d’individu molècules. El terme patch prové de la llengua anglesa i significa "patch". Es refereix a una petita secció de membrana sota la pipeta de pegat, que s’utilitza com a elèctrode de mesura. Durant el procés de mesura, el pegat de membrana es fixa o es fixa (per fixar) a potencials especificats.
Funció, efecte i objectius
La tècnica de patch-clamp és un mètode d’anàlisi electrofisiològic. Es basa en el fet biològic que les cèl·lules tenen un gran nombre de porus i canals iònics. Diferents concentracions i càrregues d’ions es produeixen dins i fora de cada cèl·lula, que depèn de l’estat fisiològic de la cèl·lula. La bicapa lipídica de la membrana no és permeable a aigua molècules així com els ions. Tanmateix, es produeix un intercanvi de partícules carregades a través del membrana cel · lular a intervals irregulars. La raó d'això és la dependència de la tensió dels canals iònics. Si s’arriba a un potencial de membrana determinat, els canals s’obren segons el principi de “tot o res”. Aquí és exactament on entra la tècnica de la pinça de pegat. D'aquesta manera, una pipeta de mesura s'avança a un canal iònic sense penetrar al membrana cel · lular. D’aquesta manera, es pot determinar amb precisió el potencial elèctric local. Els corrents de fuita, que podrien afectar el resultat de la mesura, normalment es poden evitar mitjançant connexions extremadament estretes elèctricament entre la vora de la pipeta i la membrana cel·lular. El mètode de fixació de pedaç es basa en la tècnica de subjecció de tensió. Aquesta tècnica va ser desenvolupada a la dècada de 1930 pel biofísic nord-americà Kenneth Stewart Cole (1900-1984) per mesurar els corrents de les cèl·lules nervioses que estan intactes. A la pinça de tensió, la inserció de dos elèctrodes en una cel·la té lloc per proporcionar una tensió de comandament o retenció. Al mateix temps, s’utilitza un altre elèctrode per registrar els corrents que es produeixen a través de la membrana. Si els neurofisiòlegs volen conèixer el flux de corrents elèctrics a través de zones específiques d’un cèl·lula nerviosa de membrana, utilitzen la tècnica de patch clamp. Per fer-ho, utilitzen una fina pipeta de vidre que es col·loca a l’exterior de la cel·la. Es pot crear pressió negativa aspirant-la amb l’ajut d’una xeringa hipodèrmica. Aquest procediment fa que la membrana surti lleugerament al lloc corresponent. La pressió negativa garanteix que el vidre s’uneixi a la membrana. Això es tradueix en un aïllament elèctric de la petita taca de membrana de la pipeta de la resta de la membrana. Per mesurar els corrents elèctrics, els neurofisiòlegs utilitzen un amplificador de pinces. Es tracta d’un dispositiu de mesura especial. En el cas ideal, el científic pot utilitzar el dispositiu per obtenir informació sobre les propietats elèctriques dels canals iònics individuals. Els canals iònics regulen, per exemple, l’entrada i la sortida de sodi ions, que estan carregats positivament, a les cèl·lules nervioses. La investigació té lloc sobre les cèl·lules dels humans, les plantes o els animals. El mètode de fixació de pegats es realitza generalment en una estació de mesura que inclou diversos dispositius. A la taula de mesura esmorteïda de vibracions hi ha l’anomenada gàbia Faraday, que serveix d’escut elèctric. A més, hi ha disponible un microscopi òptic que inclou un micromanipulador per posar la pipeta de pegat a la seva posició. A més, el porta-pipetes té una connexió a un preamplificador, mentre que el porta mostres està connectat a un elèctrode de bany. L'amplificador de pinces funciona per amplificar el senyal del preamplificador. També es proporciona un monitor per observar el DUT i la pipeta de pegat. En la majoria dels casos, també hi ha un ordinador i diversos dispositius d’emmagatzematge de dades a la taula de mesura per permetre la gravació digital.
Riscos, efectes secundaris i perills
No hi ha riscos associats amb la tècnica de patch-clamp. Per exemple, les cèl·lules dels humans, animals o plantes no s’examinen fins després d’haver estat eliminades. Poques vegades hi ha accés sense restriccions a la membrana cel·lular externa. Per aquest motiu, sovint és necessari preparar les cèl·lules per al mètode patch-clamp. Després d’omplir la pipeta de pegat, es fixa en un micromanipulador. Es connecta a l'amplificador de pinça de pegat i es prem suaument sobre una cel·la que està intacta. El procés es pot seguir amb un monitor o un microscopi. Sota la pipeta hi ha un tros de membrana anomenat pegat de membrana. La lleugera pressió negativa creada a l'extrem posterior de la pipeta proporciona una forta connexió entre la pipeta i la membrana. Aquest procés dóna lloc a la creació d’una resistència elèctrica entre la solució externa i l’interior de la pipeta de diversos gigaohms. Els científics també es refereixen a això com a "gigaseal", que permet aconseguir la configuració d'unió de cèl·lules del mètode patch-clamp. El corrent que flueix a través d’un canal iònic del pegat també flueix a través del contingut de la pipeta a causa de l’elevada resistència gigaseal. Un elèctrode connectat a l'amplificador està immers en la solució de la pipeta, cosa que permet mesurar les activitats dels canals iònics individuals dins de la membrana del pegat.
